台湾地区拟制定食品中胺基醣苷类抗生素残留量的检验方法（二）

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2014年3月13日，台湾地区“卫生福利部”发布部授食字第1031900272号公告，预告制定“食品中动物用药残留量检验方法－胺基醣苷类抗生素之检验（二）”草案，20天内接收公众意见或建议。

食品中动物用药残留量检验方法－胺基醣苷类抗生素之检验（二）草案

1.  适用范围：本检验方法适用于蜂蜜及乳汁中安痢霉素（apramycin）等7品项抗生素（品项见表一）之多重残留分析。

2.  检验方法：检体经萃取及净化后，以液相层析串联质谱仪（liquid chromatograph/tandem mass spectrometer, LC/MS/MS）分析之方法。

2.1. 装置：

2.1.1. 液相层析串联质谱仪：

2.1.1.1. 离子源：电洒离子化正离子（positive ion electrospray ionization, ESI+）。

2.1.1.2. 层析管柱：Agilent ZORBAX eclipse plus C18，1.7 μm，内径2.1 mm × 5 cm，或同级品。

2.1.2. 离心机（Centrifuge）：可控温达10℃以下。

2.1.3. 振荡器（Shaker）。

2.1.4. 均质机（Homogenizer）。

2.1.5. 氮气蒸发装置（Nitrogen evaporator）。

2.1.6. 固相真空萃取装置（Solid phase extraction vacuum manifolds）。

2.1.7. 旋涡混合器（Vortex mixer）。

2.2. 试药：乙腈采用液相层析级；氨水（约25%）、七氟丁酸（heptafluorobutyric acid）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、盐酸、三氯醋酸（trichloroacetic acid）及乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylene diamine tetraacetate, EDTA）均采用试药特级；去离子水（比电阻于25℃可达18 MΩ‧cm以上）；安痢霉素硫酸盐（apramycin sulfate）、双氢链霉素硫酸盐（dihydrostreptomycin-sesquisulfate）、健牠霉素硫酸盐（gentamicin sulfate）、康霉素硫酸盐（kanamycin sulfate）、新霉素硫酸盐（neomycin sulfate）、观霉素（spectinomycin-5H2O）及链霉素硫酸盐（streptomycin sulfate）对照用标准品。

2.3. 器具及材料：

2.3.1. 离心管：15及50 mL，PP材质。

2.3.2. 固相萃取匣（Solid phase extraction cartridge）：OASIS HLB cartridge，6 mL，500 mg，或同级品。

2.3.3. 滤膜：孔径0.22 μm，PVDF材质。

2.3.4. 容量瓶︰10 mL。

2.4. 试剂之调制：

2.4.1. 5%三氯醋酸缓冲溶液：

      　　取三氯醋酸50 g及磷酸二氢钾1.36 g，以去离子水溶解使成1000 mL。

2.4.2. 0.2 M EDTA溶液：

      　　取乙二胺四乙酸二钠 7.5 g ，以去离子水溶解使成100 mL。

2.4.3. 0.1 M七氟丁酸溶液：

      　　取七氟丁酸1.3 mL，加去离子水使成100 mL。

2.4.4. 冲提液：

      　　取0.1 M七氟丁酸溶液与乙腈以2：8（v/v）比例混匀。

2.4.5. 10 mM七氟丁酸溶液

      　　取七氟丁酸0.13 mL，加去离子水使成100 mL。

2.5. 移动相溶液之配制：

2.5.1. 移动相溶液A：

      　　取七氟丁酸1.3 mL，加去离子水使成1000 mL，以滤膜过滤，取滤液供作移动相溶液A。

2.5.2. 移动相溶液B：

      　　取七氟丁酸1.3 mL，加去离子水使成1000 mL，以滤膜过滤，取滤液供作移动相溶液B。

2.6. 标准溶液之配制：

    　  　取相当于含胺基醣苷类抗生素对照用标准品各约10 mg，精确称定，分别以去离子水溶解并定容至10 mL，作为标准原液，移入15 mL离心管中，于-20℃贮存。临用时分别取适量标准原液混合，以去离子水稀释至0.05～3.0 mg/mL，供作标准溶液。

　　注：由于胺基醣苷类抗生素易带正电荷，可能与玻璃器皿表面产生吸附，应使用PP材质塑料器皿，或经1 N盐酸溶液浸泡10分钟，取出并以去离子水冲洗附着之盐酸，干燥备用之玻璃器皿，以避免吸附问题。

2.7. 检液之调制：

2.7.1. 萃取：

      　　    将检体混匀后，取蜂蜜检体约5 g，精确称定，或精确量取乳汁5 mL，置于50 mL离心管中，加入5%三氯醋酸缓冲溶液25 mL和0.2 M EDTA溶液1 mL，旋涡混合1分钟，振荡5分钟，以3200 × g离心10分钟，取上清液。加入0.1 M七氟丁酸溶液5 mL，旋涡混合1分钟，以3200 × g离心5分钟，上清液以氨水调整pH值至4.0，供净化用。

2.7.2. 净化：

      　　   取2.7.1.节供净化用溶液，注入预先以乙腈5 mL、去离子水5 mL及10 mM七氟丁酸溶液5 mL润洗之固相萃取匣，弃流出液。以去离子水5 mL流洗固相萃取匣，弃流出液，再以冲提液 5 m L冲提，收集冲提液，于 60℃ 水浴中以氮气浓缩至约1 mL，再以10 mM七氟丁酸溶液定容至2 mL，经滤膜过滤，供作检液。

2.8. 基质匹配检量线之制作：

    　　   取空白检体依2.7.节萃取净化及氮气浓缩后，分别添加不同浓度标准溶液1 mL，以10 mM七氟丁酸溶液定容至2 mL，经滤膜过滤后，依下列条件进行液相层析串联质谱分析。就各抗生素之波峰面积，与对应之各抗生素添加浓度，分别制作基质匹配检量线。

    　　   液相层析串联质谱测定条件（注）：

    　　　　   层析管柱：Agilent ZORBAX eclipse plus C18，1.7 μm，内径2.1 mm × 5 cm。

    　　　　   移动相溶液：A液与B液以下列条件进行梯度分析

时间（min）	A（%）	B（%）
0.0 → 0.5	95 → 95	5 → 5
0.5 → 1.0	95 → 80	5 → 20
1.0 → 8.5	80 → 70	20 → 30
8.5 → 9.0	70 → 10	30 → 90
9.0 → 10.0	10 → 10	90 → 90
10.0 → 10.1	10 → 95	90 → 5
10.1 → 15.0	95 → 95	5 → 5

     　　　　移动相流速： 0.3 m L/min。

    　　　　注入量：5 μL。

    　　　　毛细管电压（Capillary voltage）：5.5 kV。

    　　　　溶媒挥散温度（Desolvation temperature）：550℃。

    　　　　气簾气体流速（Curtain gas flow）：20 psi。

    　　　　雾化气体（Ion source gas 1）：50 psi。

    　　　　加热气体（Ion source gas 2）：55 psi。

　　　　　　侦测模式：   多重反应侦测（multiple reaction monitoring, MRM）。侦测离子对、去集簇电压（declustering potential）与碰撞能量（collision energy）如表一。

    注：上述测定条件分析不适时，可依所使用之仪器，设定适合之测定条件。

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2.9. 鉴别试验及含量测定：

    　　   精确量取检液及标准溶液各5 μL，分别注入液相层析串联质谱仪中，依2.8.节条件进行分析。就检液与标准溶液所得波峰之滞留时间及多重反应侦测相对离子强度（注）鉴别之，并依下列计算式，求出检体中各抗生素之含量（ppm）：

                           

    　　C：由基质匹配检量线求得检液中各抗生素之浓度（μg/mL）

    　　V：检体最后定容之体积（mL）

    　　M：取样分析检体之重量（g）或体积（mL）

　　注：相对离子强度由定性离子对与定量离子对之波峰面积比而得（≦100%），容许范围如下：

相对离子强度（%）	容许范围（%）
＞50	±20
＞20～50	±25
＞10～20	±30
≦10	±50

附注：

1.  本检验方法之定量极限如表二。

2.  食品中有影响检验结果之物质时，应自行探讨。

　

表一

                                    安痢霉素等7品项抗生素之多重反应侦测模式參數

分析物		离子对	去集簇电压 （V）	碰撞能量 （eV）
英文名	中文名	前驱離子（m/z）＞ 产物離子（m/z）
Apramycin	安痢霉素	540 ＞ 217* 540 ＞ 378	76 76	35 23
Dihydrostreptomycin	双氢链霉素	584 ＞ 263* 584 ＞ 246	296 296	43 49
Gentamicin C1a	健牠霉素	450 ＞ 322* 450 ＞ 160	110 110	17 29
Gentamicin C1	－	478 ＞ 322* 478 ＞ 157	71 71	19 25
Gentamicin C2a/b	－	464 ＞ 322* 464 ＞ 160	121 121	17 29
Kanamycin	康霉素	485 ＞ 163* 485 ＞ 324	71 71	31 21
Neomycin	新霉素	615 ＞ 161* 615 ＞ 163	256 256	39 41
Spectinomycin	观霉素	351 ＞ 333* 351 ＞ 207	81 81	25 29
Streptomycin	链霉素	582 ＞ 263* 582 ＞ 246	110 110	43 53

*定量离子对

　 　

表二

                                              安痢霉素等7品项抗生素之定量极限

分析物			定量极限（ppm）
英文名	中文名		蜂蜜	乳汁
Apramycin	安痢霉素		0.05	0.02
Dihydrostreptomycin	双氢链霉素		0.1	0.05
Gentamicin C1a	健牠霉素		0.1	0.05
Gentamicin C1	－		0.1	0.05
Gentamicin C2a/b	－		0.1	0.05
Kanamycin	康霉素		0.05	0.02
Neomycin	新霉素		0.2	0.1
Spectinomycin	观霉素		0.1	0.05
Streptomycin	链霉素		0.2	0.1

　

厦门WTO工作站编

2014.3.14